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        技術支持

        細胞復蘇操作步驟


        細胞復蘇操作要點:


        1、將培養基在37℃水浴鍋預熱;準備一個15mL無菌的離心管,加入8mL預熱培養基。

        2、將凍存細胞從液氮罐中取出,快速放入37℃水浴鍋中復溫(可準備一潔凈的燒杯,裝滿37℃的水,細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內,再逐步轉移到水浴鍋中)。輕輕晃動凍存管,使細胞能在1~2min內完全解凍,使細胞能盡快通過最易受損的溫度段(-5~0℃)。注意凍存管管口不能沒入水中,避免引起污染。

        3、用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內,將管內細胞轉移至準備好的離心管內,輕輕吹打液體,使細胞均勻分散,降低DMSO濃度,吹打時避免產生氣泡。用新鮮培養基洗管壁2次,均轉移至離心管內。

        4、800rpm離心5min,棄上清,加入新鮮的培養基,吹打制成細胞懸液。

        5、將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內,補加適量的培養基,輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻,放入溫箱內培養。

        6、第二天觀察細胞貼壁生長情況,換新鮮培養基以去除死細胞。繼續培養,待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經過2~3次傳代,細胞活力恢復后才能進行后續的實驗。

        對DMSO不敏感的細胞在復蘇時也可不離心,減少操作步驟,也可降低污染的幾率。將解凍的細胞懸液直接轉移至T25細胞瓶內,補加新鮮培養基,放入溫箱內培養。但培養12~20h后必須換新鮮的培養基,移除死細胞。



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